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Ultimo aggiornamento
10 Settembre 2012


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Biomateriali: la ricerca


Le bioprotesi tridimensionali

La ricostruzione dei tessuti osseo e cartilagineo tramite impianti di cellule e tessuti autologhi è una delle più promettenti prospettive per l'ingegneria tissutale e per la chirurgia ortopedica. Queste tecniche potrebbero poi essere abbinate all'utilizzo delle biotecnologie farmaceutiche per realizzare sistemi di rilascio di principi attivi terapeutici favorenti l'adesione delle cellule e la vascolarizzazione dei costrutti. Si eliminerebbero così problemi legati alla scarsità dei donatori, alle reazioni di rigetto e alla trasmissione di organismi patogeni. In tale ottica riveste sicuro interesse l'ipotesi di utilizzare una matrice ossea naturale o sintetica che possa accogliere osteoblasti estratti dal paziente stesso al fine di ricostruire la forma e la funzionalità del tessuto originario. In questa ottica sono stati sviluppati in vitro supporti biocompatibili costituiti sia da matrice acellulare ossea trattata, sia da biopolimeri sintetici, tutto al fine di realizzare bioprotesi tridimensionali ossee per chirurgia maxillo-facciale e ortopedica. È intuibile l'importanza della scelta dei materiali che possono sostituire la matrice ossea nel ripristino di tessuti danneggiati, poiché ad essa si affida il ruolo attivo e complesso nella regolazione del comportamento delle cellule con cui entra in contatto influenzandone lo sviluppo, la migrazione, la proliferazione, la forma e la funzione metabolica. Da qui la necessità di approfondite ricerche nell'ambito della struttura, della porosità e delle proprietà superficiali di questi biomateriali che sono essenziali al fine garantire l'osteointegrazione e l'osteoconduttività.

Per creare le matrici i polimeri sono stati lavorati mediante stereolitografia, una tecnica che permette di realizzare singoli oggetti tridimensionali a partire da dati digitali elaborati da un apposito software. Questo procedimento di prototipizzazione permette una produzione rapida ed economica permettendo di creare sia pezzi in risoluzione standard sia componenti ad alta definizione con altissima resa di particolari. Il processo è gestito da un sistema di scansione integrato ad alta velocità (TAC) con elaborazione digitale del segnale in grado di riprodurre l'oggetto secondo il progetto elaborato al computer.

Sono state così messe a punto matrici di polifosfazeni e polilattidi sottoforma di filamento. I supporti così creati sono stati sterilizzati e successivamente caratterizzati tramite analisi con microscopia elettronica a scansione. Questo ha permesso di evidenziare la struttura microscopica dei filamenti e la loro porosità, cosa essenziale ai fini dell'adesione cellulare e per la successiva crescita e differenziazione degli osteociti da impiantare. Il controllo effettuato su matrice ossea naturale ha evidenziato che il polifosfazene ed il polilattide favoriscono adesione e crescita cellulare in misura maggiore rispetto al convenzionale polistirene attualmente utilizzato. Per l'ottenimento di supporti biocompatibili naturali sono stati usati femori di ratto Sprague-Dowley adulti. Il trattamento iniziale ha previsto la privazione del tessuto connettivo e lavaggi con soluzione salina contenente antibiotici. Successivamente il tessuto è stato demineralizzato con una soluzione di EDTA, e poi trattato con il metodo di Meezan per ottenere una matrice acellulare.

Per verificare la completa biocompatibilità dei supporti sezioni di matrice ossea di 5μm ottenute dopo inclusione in paraffina, sono state analizzate per la presenza di diversi antigeni. Le colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche hanno evidenziato la completa assenza di elementi cellulari, l'assenza degli antigeni del complesso maggiore di immunoistocompatibilità (HLA I) e la presenza di fattori angiogenici come FGF-2 e il TGF-beta1.

Come modello per l'impianto cellulare sono state utilizzate colture di osteoblasti da midollo osseo di ratto Sprague-Dowley. Dopo la semina si sono testate le condizioni delle cellule all'interno della matrice per verificarne sopravvivenza, attecchimento e crescita. I risultati sono stati ottimi, infatti l'osservazione del fenotipo ha rivelato la presenza dell'enzima fosfatasi alcalina, la deposizione di matrice ossea, nucleo ben evidente e capacità di stratificazione. Tramite microscopia elettronica si è evidenzia forma poligonale della cellula con nucleo ben evidente e capacità di stratificazione.

A 72 ore dalla semina delle colture di osteoblasti su matrice ossea decellularizzata si nota un aumento del numero di cellule adese. I risultati ottenuti dal progetto lasciano ben sperare per una successiva applicazione sull'uomo, soprattutto nella popolazione anziana con necessità di protesi ortopediche e per pazienti prevalentamente giovani che necessitano di processi di ricostruzione maxillo-facciale ed ortopedica in seguito ad eventi traumatici.

Il confinamento cellulare tramite tecnologia BIOSIL

I fenomeni di rigetto immunologico da parte dell'organismo ospite sono ancora un limite importante e finora non superato per trapianti xeno ed allogenici di cellule e tessuti animali. Questa reazione di rigetto è attualmente controllata mediante la somministrazione di farmaci immunosoppressori e, almeno per la terapia cellulare, a dispositivi di incapsulamento che costituiscano un filtro al passaggio di molecole immunitarie. Premessa all' incapsulazione è il fatto che le cellule da impiantare isolate in un ambiente artificiale possono essere protette dal meccanismo distruttivo del sistema immunitario che le ospita. I maggiori problemi ancora da superare nell'incapsulazione sono:
  • Selezione di una fonte illimitata di cellule
  • Prevenzione della morte della cellula all'interno dei dispositivi di incapsulazione (a causa del poco ossigeno e nutrimento).
  • Selezione di un materiale biocompatibile
  • Induzione all'immunotolleranza

La micro-incapsulazione sembra essere la tecnica più promettente per l'immunoisolamento. La popolazione cellulare inserita, è quindi circondata da una membrana artificiale, che funge da barriera, ma che è selettivamente permeabile, permettendo alle cellule inserite di svolgere la loro funzione (ad esempio secernere insulina nel caso di un trapianto di cellule beta).

Il secondo progetto finanziato in questo ambito prevede di verificare la stabilità a lungo termine di un sistema di incapsulamento cellulare a scopo terapeutico basato sulla tecnologia Biosil, che genera una pellicola porosa di silice con notevoli proprietà di stabilità meccanica ed inerzia chimica. Il fine ultimo della ricerca è stato quello di verificare stabilità e biopersistenza a lungo termine della pellicola Biosil dopo impianto in vivo, e del mantenimento delle proprietà immunoisolanti e di biocompatibilità.

Tra le metodiche di incapsulamento cellulare, le più impiegate utilizzano strati di polimeri organici policationici (quali poli-lisina) in associazione con gel di alginato, per rivestire le cellule o le microcapsule che le contengono, ci sono ancora diversi problemi riguardanti la stabilità in vivo di questi materiali per trattamenti a lungo termine. Più nel dettaglio la tecnologia Biosil, genera un rivestimento poroso di silice (SiO2) su microsfere di alginato di calcio con proprietà di stabilità meccanica e chimica, applicabile su superfici di diversi materiali. Per la realizzazione delle microsfere si utilizza un sistema di estrusione ad ago, in cui il flusso d'aria, necessario al distacco delle gocce di alginato, è arricchito in alcossidi di silicio che investono direttamente la superficie della microsfera. Diversi dati preliminari presenti in letteratura indicano l'elevata biocompatibilità delle microsfere ottenute con la tecnologia Biosil lasciando presupporre una buona tolleranza "in vivo" se utilizzate come sistema di immunoprotezione di cellule impiantate in tessuti allo/ xenogenici. Il processo di preparazione delle microsfere è stato adattato alla generazione di strati con diverso spessore e porosità. La scelta delle caratteristiche generali e biologiche del rivestimento è finalizzata al conferimento di biocompatibilità ed immunoisolamento, oltre che di stabilità meccanica. Un secondo punto importante inoltre, è quello relativo alle dimensioni delle microsfere, il cui diametro deve essere compreso tra 150 e 250 um e non superiore, in modo da consentire una diffusione completa sino all'area centrale della microsfera delle sostanze nutritive, dei gas disciolti nel mezzo di cultura e dei metaboliti cellulari. La standardizzazione ha richiesto il controllo della conservazione della vitalità cellulare nonché l'efficienza di incapsulamento che può variare a seconda del tipo di cellula utilizzata. La stabilità a lungo termine (fino a 6 mesi) dello strato Biosil è stata fatta in vivo, controllando l'effetto delle microsfere nel sito di impianto stesso, sia con che senza cellule incapsulate.

L'obbiettivo principale è stato quindi sia la verifica della persistenza dello strato di silice a seguito dell'impianto a lungo termine in vivo (almeno 6 mesi), mantenendo le caratteristiche di porosità e di biocompatibilitàsia sia la durata della vitalità delle cellule incapsulate e il loro confinamento a lungo termine da parte della microsfera e del rivestimento Biosil.

A seguito della verifica a sei mesi di distanza dall'impianto, le microsfere in tessuto muscolare di ratto e nel peritoneo di topo erano ancora presenti; in particolare si è osservata la conservazione della biocompatibilità delle microsfere in entrambi tipi di tessuto. Inoltre la capacità di confinamento di cellule tumorali incapsulate è rimasta invariata nonostante il lungo periodo senza danneggiare il tessuto circostante. La totale assenza di aggressione da parte dei tessuti e la mancata risposta sistemica dell'animale sono prova di come il rivestimento Biosil in sé non provochi alcuna reazione da corpo estraneo e risulta conservare a lungo termine le sue proprietà di biocompatibilità. Come ulteriore conferma le microsfere sono state anche impiantate con all'interno cellule tumorali, in questo particolare caso la risposta cambia. Infatti è ben evidente una risposta immediata da parte delle cellule del peritoneo che si manifesta già alla seconda settimana dall'impianto mediante una risposta immunitaria, con conseguente aggressione delle microsfere. Visto che le cellule cancerose hanno rappresentato in questo caso la differenza tra i due esperimenti è chiaro come la causa della risposta da parte dell'organismo è dovuta a queste ultime che probabilmente rilasciano molecole permeabili allo strato di Biosil e che fungono da "chemioattrattori" che attivano il sistema immunitario. Le cellule tumorali tuttavia rimangono confinate.
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